glaucomaНациональный журнал ГлаукомаNational Journal glaucoma2078-41042311-6862Federal State Budgetary Institution of Science “Krasnov Research Institute of Eye Diseases”glaucoma-181Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИORIGINAL ARTICLESОЦЕНКА ВОЗМОЖНОСТЕЙ СНИЖЕНИЯ ТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ АНТИГЛАУКОМНОГО ГИПОТЕНЗИВНОГО ПРЕПАРАТА, СОДЕРЖАЩЕГО КОНСЕРВАНТ БЕНЗАЛКОНИЯ ХЛОРИД, НА ПЕРВИЧНУЮ КУЛЬТУРУ КЛЕТОК ЛИМБА РОГОВИЦЫ С ПОМОЩЬЮ СЛЕЗОЗАМЕНИТЕЛЯ СТИЛЛАВИТR (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)EVALUATION OF STILLAVITR ARTIFICIAL TEARS POTENTIAL IN REDUCING THE TOXIC EFFECT OF BENZALKONIUM CHLORIDE-CONTAINING HYPOTENSIVE INSTILLATIONS ON PRIMARY CELL CULTURE OF THE CORNEAL LIMBUS (EXPERIMENTAL STUDY)ЕгороваГ. Б.EgorovaG. В.

Доктор медицинских наук, главный научный сотрудник отдела рефракционных нарушений

Москва, 119021, ул. Россолимо, 11А, Б

Med.Sc.D., Senior research associate of the Refractive Disorders department

11A Rossolimo st., Moscow, 119021

ЕричевВ. П.ErichevV. P.

Доктор медицинских наук, профессор, заместитель директора по инновационной деятельности

Москва, 119021, ул. Россолимо, 11А, Б

Med.Sc.D., Professor, Deputy Director for Innovative Studies

11A Rossolimo st., Moscow, 119021

СубботА. М.SubbotA. M.

Кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник лаборатории фундаментальных исследований в офтальмологии

Москва, 119021, ул. Россолимо, 11А, Б

Ph.D., Senior research associate of the Laboratory of fundamental research in ophthalmology

11A Rossolimo st., Moscow, 119021

ФедоровА. А.FedorovA. A.

Кандидат медицинских наук, заведующий лабораторией фундаментальных исследований в офтальмологии

Москва, 119021, ул. Россолимо, 11А, Б

Ph.D., Head of the Laboratory of fundamental research in ophthalmology

11A Rossolimo st., Moscow, 119021

НестероваТ. В.NesterovaT. V.

Лаборант-исследователь лаборатории фундаментальных исследований в офтальмологии

Москва, 119021, ул. Россолимо, 11А, Б

Laboratory researcher of the Laboratory of fundamental research in ophthalmology

11A Rossolimo st., Moscow, 119021

ГабашвилиА. Н.GabashviliA. N.

Научный сотрудник лаборатории фундаментальных исследований в офтальмологии

Москва, 119021, ул. Россолимо, 11А, Б

Research associate of the Laboratory of fundamental research in ophthalmology

11A Rossolimo st., Moscow, 119021

АверичВ. В.AverichV. V.

Аверич Вероника Валерьевна, младший научный сотрудник отдела рефракционных нарушений

Москва, 119021, ул. Россолимо, 11А, Б

Junior research associate of the Department of refractive disorders

11A Rossolimo st., Moscow, 119021

veronikky@mail.ruФГБНУ «НИИ глазных болезней»РоссияScientific Research Institute of Eye DiseasesRussian Federation2017050420181643136Copyright © Егорова Г.Б., Еричев В.П., Суббот А.М., Федоров А.А., Нестерова Т.В., Габашвили А.Н., Аверич В.В., 20182018Егорова Г.Б., Еричев В.П., Суббот А.М., Федоров А.А., Нестерова Т.В., Габашвили А.Н., Аверич В.В.Egorova G.В., Erichev V.P., Subbot A.M., Fedorov A.A., Nesterova T.V., Gabashvili A.N., Averich V.V.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.glaucomajournal.ru/jour/article/view/181ЦЕЛЬ

ЦЕЛЬ. Оценка цитотоксичности антиглаукомного гипотензивного препарата, содержащего в составе бензалкония хлорид, и протекторного действия слезозаменителя СтиллавитR на культуре клеток лимба роговицы.

 МЕТОДЫ

 МЕТОДЫ. Тестируемые образцы: латанопрост 0,005%, в качестве консерванта используется бензалкония хлорид 0,02% (БХ); СтиллавитR (натрия гиалуронат 0,16%, хондроитина сульфат натрия 0,05%, D-пантенол 1%, консервант — тетраборат натрия 0,05%). Была использована первичная культура клеток лимба роговицы. На первом этапе исследования оценивали эффект воздействия на клеточную культуру препаратов в 100% концентрации: латанопрост+БХ; и с одновременным добавлением в культуру Стиллавита. На втором этапе был проведен анализ влияния последовательных разведений препаратов на показатели цитотоксичности. Задачей третьего этапа была оценка уровня жизнеспособности клеток после экспозиции их с разведенными веществами в различной комбинации: латанопрост+БХ (воздействие в течение 30 минут); последовательное добавление в культуру Стиллавита и затем через 30 минут добавление препарата (латанопрост+БХ); одновременное добавление в культуру Стиллавита и препарата (латанопрост+БХ). Для оценки жизнеспособности клеток в культуре был проведен МТС-тест с использованием набора CellTiter 96R AQueous One Solution Reagent («Promega»). Дополнительно проводилось цитологическое исследование полученных результатов.

РЕЗУЛЬТАТЫ

РЕЗУЛЬТАТЫ. Уровень жизнеспособности клеток при внесении препарата (латанопрост+БХ) в 100% концентрации составляет 13,95Ѓ}4,014%. При внесении исследуемого антиглаукомного препарата совместно со Стиллавитом уровень жизнеспособности достигает 22,03Ѓ}3,152%. В результате второй серии экспериментов было установлено, что выживаемость клеток на уровне 60-80% наблюдается при разведении препарата (латанопрост+БХ) в образце в 32 раза, а в отношении препарата к объему составляет 6,25%. На третьем этапе оценивали уровень жизнеспособности клеток при внесении к ним препаратов в разведении 6,25%. Уровень выживаемости клеток при воздействии препарата латанопрост+БХ составил 68,49Ѓ}20,61%. Было установлено, что как предварительное за 30 минут до внесения препарата (латанопрост+БХ), так и одновременное добавление Стиллавита увеличивает показатели выживаемости клеточной культуры — 94,95Ѓ}12,52 и 103,8Ѓ}12,45% соответственно. Наблюдаемые различия статистически значимы при уровне надежности 95%.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ. По результатам проведенных исследований in vitro были доказаны цитопротекторные свойства слезозаменителя Стиллавит в комбинации с препаратом, содержащим латанопрост+БХ, как при их 100%, так и 6,25% концентрации, что было подтверждено с помощью цитологического исследования.

PURPOSE

PURPOSE: To evaluate the cytotoxicity of hypotensive instillation containing benzalkonium chloride and the protective effect of StillavitR artificial tears on the corneal limbus primary cell culture.

METHODS

METHODS: Test samples: 1) latanoprost 0.005%, containing benzalkonium chloride (BC) 0.02% as a preservative agent 2) StillavitR, containing sodium hyaluronate 0,16%, chondroitin sulfate sodium of 0.05%, D-panthenol 1% and sodium tetraborate 0,05% acting as preservative. Primary cell culture of the corneal limbus was used for the assessment. At the first stage of the research we estimated the effect of a 100% concentration of latanoprost+BC and Stillavit on the cell culture. At the second stage we analyzed the influence of agents’serial dilution on cytotoxicity indicators. The aim of the third stage was the assessment of cell viability level after their exposure to diluted substances in three various combinations: single latanoprost + BC (30 min exposure); simultaneous and consecutive adding of Stillavit and latanoprost + BC to the culture with a 30 min interval. To evaluate the cell culture viability we carried out MTS test using CellTiter 96R AQueous One Solution Reagent («Promega»). Obtained results underwent additional cytological examination.

RESULTS

RESULTS: Cell viability level after the exposure to a 100% concentration of latanoprost+BC amounted to 13.95Ѓ}4.014%. In cases of exposing the culture to a combination of latanoprost + BC and Stillavit, viability level reached 22.03Ѓ}3.152%. The second stage of the research revealed that the cell culture has a survival rate of 60-80% if the drug (latanoprost + BC) in the sample is diluted 32-fold, and in relation to drug volume amounts to 6.25%. Consequently, in the third stage of the research we evaluated cell viability level exposing them to a 6.25% dilution of the drug. Cell survival rate after single latanoprost + BC exposure equaled 68.49Ѓ}20.61%. Both simultaneous and consecutive adding of Stillavit (30 min prior to the drug) increased cell survival rate: 94.95Ѓ}of 12.52 and 103.8Ѓ}12.45% respectively. The observed difference was statistically significant in both cases (95% reliability level).

цитотоксичностьбензалкония хлоридкультура клеток лимба роговицыглаукомаантиглаукомная терапияСтиллавитcytotoxicitybenzalkonium chloridecell culture corneal limbusglaucomaglaucoma therapyStillavitReferencesЕричев В.П., Амбарцумян К.Г. Консерванты и вторичный синдром ≪сухого глаза≫ при длительной местной медикаментозной терапии первичной открытоугольной глаукомы. Глаукома 2011; 2:59-66. [Erichev V.P., Ambartsumyan K.H. The preservatives and secondary dry eye syndrome in long-term topical open-angle glaucoma therapy. Glaucoma 2011; 2:59-66. (In Russ.)].Erichev V.P., Ambartsumyan K.H. The preservatives and secondary dry eye syndrome in long-term topical open-angle glaucoma therapy. Glaucoma 2011; 2:59-66. (In Russ.).Еременко А.И., Янченко С.В. Классификация факторов риска при вторичном сухом глазе. Фундаментальные исследования 2006; 7:34. [Eremenko A.I., Yanchenko S.V. Classification of risk factors in secondary dry eye. Fundamental research 2006; 7:34. (In Russ.)].Eremenko A.I., Yanchenko S.V. Classification of risk factors in secondary dry eye. Fundamental research 2006; 7:34. (In Russ.).Федоров А.А. Морфологические основы научных исследований в офтальмологии. Вестник офтальмологии 2013; 129(5):10-21 [Fedorov A.A. Morphological bases of scientific researches in ophthalmology. Vestn oftalmol 2013; 129(5):10-21. (In Russ.)].Fedorov A.A. Morphological bases of scientific researches in ophthalmology. Vestn oftalmol 2013; 129(5):10-21. (In Russ.).Ammar D.A., Noecker R.J., Kahook M.Y. Effects of benzalkonium chloride-and polyquad-preserved combination glaucoma medications on cultured human ocular surface cells. Advances in therapy 2011; 28(6):501-510. https://doi.org/10.1007/s12325-011-0029-xAmmar D.A., Noecker R.J., Kahook M.Y. Effects of benzalkonium chloride-and polyquad-preserved combination glaucoma medications on cultured human ocular surface cells. Advances in therapy 2011; 28(6):501-510. https://doi.org/10.1007/s12325-011-0029-xKhoh-Reiter S., Jessen B.A. Evaluation of the cytotoxic effects of ophthalmic solutions containing benzalkonium chloride on corneal epithelium using an organotypic 3-D model. BMC ophthalmology 2009; 9(1):5. https://doi.org/10.1186/1471-2415-9-5Khoh-Reiter S., Jessen B.A. Evaluation of the cytotoxic effects of ophthalmic solutions containing benzalkonium chloride on corneal epithelium using an organotypic 3-D model. BMC ophthalmology 2009; 9(1):5. https://doi.org/10.1186/1471-2415-9-5Rolando M. et al. The effect of different benzalkonium chloride concentrations on human normal ocular surface: a controlled prospective impression cytology study. The Lacrimal System. Amsterdam: Kagler&Ghedini; 1991:89-91.Rolando M. et al. The effect of different benzalkonium chloride concentrations on human normal ocular surface: a controlled prospective impression cytology study. The Lacrimal System. Amsterdam: Kagler&Ghedini; 1991:89-91.Rasmussen C.A., Kaufman P.L., Kiland J.A. Benzalkonium chloride and glaucoma. J Ocular Pharmacol Ther 2014; 30(2-3):163-169. https://doi.org/10.1089/jop.2013.0174Rasmussen C.A., Kaufman P.L., Kiland J.A. Benzalkonium chloride and glaucoma. J Ocular Pharmacol Ther 2014; 30(2-3):163-169. https://doi.org/10.1089/jop.2013.0174Yanochko G.M. et al. Comparison of preservative-induced toxicity on monolayer and stratified Chang conjunctival cells. Toxicology in Vitro 2010; 24(4):1324-1331. https://doi.org/10.1016/j.tiv.2010.02.001Yanochko G.M. et al. Comparison of preservative-induced toxicity on monolayer and stratified Chang conjunctival cells. Toxicology in Vitro 2010; 24(4):1324-1331. https://doi.org/10.1016/j.tiv.2010.02.001

The authors declare that there are no conflicts of interest present.